Automatische kolonietellers
Het tellen van bacteriekolonies is een traag, eentonig en arbeidsintensief proces dat constante alertheid vereist van een getrainde laborant. De huidige automatische kolonietellers vereisen een nauwgezette training en setup procedure per type product en per type bacterie en kunnen dus slecht om met diversiteit. Dit is in tegenstelling met de vereisten van microbiologische laboratoria waar dagelijks een wijde range aan levensmiddelen en types bacteriën gescreend worden. Imec verkent nu het potentieel van hyperspectrale beeldvorming voor automatische kolonietelling én identificatie van het type bacterie, gebaseerd op de specifieke hyperspectrale handtekening. Hiertoe werden verschillende levensmiddelen uitgeplaat op specifieke voedingsbodems en geëvalueerd met de hyperspectrale opstelling (Figuur 1).
Figuur 1: Hyperspectrale opstelling bij Imec (Masschelein et al. 2012)
|
Hyperspectrale beeldvorming Hyperspectrale camera’s [4] combineren de hoge spatiale resolutie van de moderne digitale camera’s met de hoge spectrale resolutie van een spectrometer. Voor elke pixel in een beeld registreert de camera voor verschillende spectrale banden de lichtintensiteit, wat resulteert in een specifieke spectrale handtekening voor iedere pixel. |
Selectieve voedingsbodems
Figuur 2 geeft de spectra weer voor verschillende bacteriën op selectieve media alsook drie principale componenten. Hieruit komt duidelijk naar voor dat bacteriën op hun selectieve media een specifieke spectrale handtekening vertonen, die toelaat ze van elkaar te onderscheiden en te identificeren.
|
Selectieve voedingsbodems voor Enterobacteriaceae en Melkzuurbacteriën Enterobacteriaceae is een familie van verschillende bacteriën waaronder E.coli en Salmonella. Melkzuurbacteriën groepen onder meer Lactobacillus, Lactococcus en Streptococcus. De VRGB (Violet Red Bile Glucose) en MRS (de Man, Rogosa, Shape) platen zijn selectief voor respectievelijk Enterobacteriaceae en Melkzuurbacteriën, maar zijn niet in staat een specifiek genus of species in de familie te onderscheiden |
De variatie in de hyperspectrale spectra van de Enterobacteriaceae over de verschillende platen was te beperkt om toegeschreven te kunnen worden aan verschillende species. De hyperspectrale spectra van de melkzuurbacteriën op de verschillende platen vertoonden meer variatie, wat erop wijst dat hyperspectrale beeldvorming mogelijk in staat is verschillende species binnen de groep van melkzuurbacteriën te onderscheiden op MRS platen. Dit opent perspectieven voor het diagnosticeren van deze groep van bacteriën in microbiologische laboratoria.
Figuur 2: (a) Hyperspectrale spectra van verschillende bacteriën op selectieve media en (b) de hiervan afgeleide principale componenten (Masschelein et al., 2012)
Invloed van voedingsbodem op spectrale handtekening
Verschillende bacteriën hebben dus een unieke spectrale handtekening wanneer ze groeien op hun specifiek selectief medium. De vraag stelt zich dus of de spectrale handtekening van een specifieke bacterie dezelfde blijft wanneer ze groeien op verschillende voedingsbodems. Uit experimenten met E. coli, Staph. Aureus, Salmonella, melkzuurbacteriën en Enterobacter cloaca op 5 verschillende agars bleek dat de spectrale handtekening van bacteriën significant beïnvloed wordt door het medium waarop ze groeien. Een van de redenen hiervoor is dat de groeimedia vaak een specifieke kleur hebben die de spectra beïnvloedt. Het lijkt dus niet mogelijk om een database te creëren van de spectrale handtekening van verschillende bacteriën om zo verschillende platen te classificeren, onafhankelijk van het groeimedium. Dit zou kunnen worden opgelost door het groeimedium in te voeren als variabele in de database zodat op basis van het groeimedium de juiste subset spectrale handtekeningen geselecteerd wordt.
Niet-selectieve voedingsbodems: onderscheid verschillende bacteriën mogelijk?
Op PCA platen had Staphylococcus aureus een duidelijk verschillend spectrum, terwijl de spectra van E.coli, Enterobacteriaceae en Salmonella onderling meer gelijkenissen vertoonden (Figuur 3). Dit suggereert dat niet-specifieke groeimedia gebruikt kunnen worden om een onderscheid te maken tussen verschillende soorten bacteriën. Bovendien kan dit ook resulteren in een reductie van opslag en kost van voedingsbodems.
Figuur 3 Spectra van verschillende bacteriën op PCA en PCA zelf (Masschelein et al; 2012)
Classificatie en telling van kolonies
Een classificatiealgoritme werd opgesteld aan de hand van een subset aan pixels voor alle bacterie-types (E.coli, Staph. Aureus, Enterobacteriaceae) en de PCA agar. Dit algoritme werd vervolgens toegepast op de geïncubeerde voedingsbodems. De hyperspectrale classificatieresultaten werden vergeleken met deze bekomen via RGB camera’s. Hoewel de dataset te beperkt is om statistisch significante resultaten te bekomen, geven ze toch een goede indicatie dat hyperspectrale data met succes gebruikt kunnen worden om verschillende types bacteriën te identificeren en kolonies te tellen. Dit wordt in Figuur 4 geïllustreerd voor Salmonella en Enterobacter cloaca op PCA agar. Classificatie van de hyperspectrale beelden resulteerden in foutenpercentage van minder dan 1%. Op de RGB beelden liep dit foutenpercentage op tot 21%.
Figuur 4: Classificatie van RGB data en hyperspectrale data bekomen via twee verschillende benaderingen aan de hand van een classificatiealgoritme. Bovenste rij: resultaten voor Salmonella, onderste rij: resultaten voor Enterobacter cloaca (Masschelein et al. 2012)
Kolonies tellen
De eigenlijke telling van de kolonies aanwezig op de voedingsbodem gebeurt via een opeenvolging van morfologische filters. Deze stappen omvatten ondermeer de selectie van de kolonies, de verwijdering van ongewenste informatie en het toepassen van beeldverwerkingtechnieken. Dit proces wordt geïllustreerd in Figuur 5.
Figuur 5. Beeldverwerkingsprocedure voor een automatische kolonietelling (Masschelein et al. 2012)
Meer weten
Voor meer informatie en het volledige artikel kan u terecht bij Bart Masschelein (Bart.Masschelein@imec.be [3] of +32 (0) 16 288 144)
Bronnen
B. Masschelein, A. Robles-Kelly, C. Blanch, N. Tack, B. Simpson-Young, A. Lambrechts (2012), Towards a colony counting system using hyperspectral imaging, Proceedings of SPIE 8225, 822510, http://dx.doi.org/10.1117/12.908041
